ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ 5 Μοριακή ανίχνευση-ταυτοποίηση ιού του ανθρώπινου θηλώματος (HPV)
  • Η HPV λοίμωξη αποτελεί μία από τις συχνότερες σεξουαλικώς μεταδιδόμενες ασθένειες. Είναι χαρακτηριστικό ότι 3 στους 4 σεξουαλικά ενεργούς ενήλικες έχουν υπάρξει για κάποιο διάστημα στη διάρκεια της ζωής τους φορείς του ιού HPV, ενώ η πιθανότητα μία νέα γυναίκα να μολυνθεί από HPV στη διάρκεια της ζωής της ανέρχεται στο ≈80%. 
  • Η λοίμωξη από HPV μπορεί να κυμαίνεται από ασυμπτωματική, μέχρι συμπτωματική μέσω της εκδήλωσης κονδυλωμάτων στα γεννητικά όργανα των ανδρών και γυναικών, αλλά πλέον σημαντικά, ογκογόνος μέσω της πρόκλησης καρκίνου του τραχήλου της μήτρας αλλά και πιο σπάνιων μορφών καρκίνου όπως αιδοίου, κόλπου, πρωκτού και πέους. Είναι πλέον πλήρως κατανοητό ότι ο ιός HPV ευθύνεται σχεδόν πλήρως (>99%) για την ανάπτυξη καρκίνου του τραχήλου. 
  • Περισσότεροι από 200 υποτύποι του ιού HPV έχουν χαρακτηριστεί μέχρι σήμερα, από τους οποίους 40 μολύνουν το κατώτερο γεννητικό σύστημα και ευθύνονται για τις διαφορετικού τύπου επιπτώσεις του ιού στον άνθρωπο. Οι πλέον σημαντικοί από κλινική άποψη είναι οι υποτύποι HPV-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, -66, και -68, που κατηγοριοποιούνται ως υποτύποι υψηλού-κινδύνου (high-risk), καθώς διαθέτουν εν δυνάμει ογκογόνο δυναμικό και σε περίπτωση εμμένουσας λοίμωξης οδηγούν στην ανάπτυξη προκαρκινικών αλλοιώσεων. Οι υψηλού-κινδύνου υποτύποι HPV ευθύνονται για το ≈83% των περιστατικών προκαρκινικών αλλοιώσεων του τραχηλικού επιθηλίου, ενώ δύο από αυτούς, οι HPV-16 και HPV-18, ασκούν την πλέον ογκογόνο δράση, καθώς είναι υπεύθυνοι για την ανάπτυξη ≈55% και ≈15%, αντίστοιχα, των περιστατικών καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Το υπόλοιπο ≈17% των ανιχνευθέντων προκαρκινικών επιθηλιακών αλλοιώσεων αποδίδεται σε εμμένουσα λοίμωξη από του λεγόμενους ενδιάμεσου-κινδύνου (intermediate-risk) υποτύπους του ιού HPV, στους οποίους περιλαμβάνονται οι HPV-26, -53, -73 και -82, ενώ οι υποτύποι HPV-6, -11, -40, -42, -43, -44, -54, -61, -62, -70, -71, -72, -81, -83, -84, -85 και -89 κατηγοριοποιούνται ως χαμηλού-κινδύνου (low-risk) και ευθύνονται για την εκδήλωση συμπτωμάτων χαμηλότερης κλινικής βαρύτητας, όπως κονδυλώματα και θηλώματα. 
  • Μέχρι πρότινος, η διάγνωση της HPV λοίμωξης γινόταν εξ’ ολοκλήρου μέσω του τεστ Παπανικολάου (τεστ PAP), όπου η ύπαρξη μόλυνσης ελέγχεται μακροσκοπικά μέσω ιστοχημικής εξέτασης επιχρίσματος κυττάρων από τον τράχηλο της μήτρας. Η μέθοδος αυτή, αν και ιδιαιτέρως αποτελεσματική, έχει αρκετά χαμηλή ευαισθησία (53-75%) γεγονός που οδηγεί σε αρκετά ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα αλλά και σε καθυστερημένη διάγνωση της HPV λοίμωξης και μόνο όταν αυτή έχει φτάσει στο επίπεδο που δίνει μακροσκοπικά στοιχεία. Παγκοσμίως, ≈10% των γυναικών όλων των ηλικιών με φυσιολογικό τεστ PAP είναι φορείς του ιού HPV, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό στην Ελλάδα κυμαίνεται στο ≈6%.

Ανίχνευση-ταυτοποίηση ιού HPV σε επίπεδο DNA (HPV DNA test).

  • Οι εξελίξεις στο χώρο της μοριακής βιολογίας έδωσαν τη βάση για μία από τις σημαντικότερες ανακαλύψεις στο χώρο της μοριακής διαγνωστικής, το επονομαζόμενο HPV DNA test. Πλέον, μέσω της ανάλυσης του ιού σε επίπεδο γονιδιώματος και με την εφαρμογή της ευαίσθητης τεχνικής PCR, είναι δυνατή η έγκαιρη και ακριβής ανίχνευση του ιού στα κύτταρα πολύ πριν αυτά εκδηλώσουν μακροσκοπικά χαρακτηριστικά μόλυνσης. Είναι χαρακτηριστικό ότι, με την εφαρμογή του HPV DNA τεστ, η αναγνώριση γυναικών με προκαρκινικές αλλοιώσεις ή διηθητικό καρκίνο τραχήλου της μήτρας γίνεται 2-3 χρόνια νωρίτερα, απ’ ότι αν εφαρμοσθεί για τον ίδιο λόγο το τεστ PAP. Επιπλέον, είναι δυνατός ο μοριακός χαρακτηρισμός των διαφόρων υποτύπων του ιού, επιτρέποντας με αυτόν τον τρόπο τη διάγνωση των εν δυνάμει ογκογόνων περιστατικών. 
  • Εξαιτίας της πολύ υψηλής ευαισθησίας του (93-96%), το HPV DNA τεστ προτείνεται ως μέσω μαζικού προληπτικού ελέγχου (screening) του πληθυσμού, είτε ως αυτόνομου, σε γυναίκες ηλικίας ≥30 ετών, είτε σε συνέργεια με το τεστ PAP, σε γυναίκες ηλικίας 25-29 ετών. Το HPV DNA τεστ έχει πολύ υψηλή αρνητική προγνωστική αξία, κάτι που καταδεικνύεται από το γεγονός ότι ένα αρνητικό τεστ προσφέρει διπλάσια προστασία και για διπλάσιο χρονικό διάστημα σε σύγκριση με ένα αρνητικό τεστ PAP. 
  • Το εργαστήριο μας πραγματοποιεί έλεγχο ανίχνευσης 24 υποτύπων του ιού HPV, εκ των οποίων 13 ανήκουν στην κατηγορία υψηλού-κινδύνου (high-risk) (HPV-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59, -68), 5 ανήκουν στην κατηγορία ενδιάμεσου-κινδύνου (intermediate-risk) (HPV-26, -53, -66, -73, -82) και 6 υποτύποι ανήκουν στην κατηγορία χαμηλού-κινδύνου (low-risk) (HPV-6, -11, -42, -43, -44, -81). Η ανίχνευση πραγματοποιείται με τη μέθοδο της real-time RT-PCR. 
  • Δείγμα: επίχρισμα κυττάρων από το επιθήλιο του τραχήλου της μήτρας. 
  • Χρόνος απάντησης: 5-7 εργάσιμες ημέρες.

Ανίχνευση-ταυτοποίηση ιού HPV σε επίπεδο mRNA (HPV mRNA test).

  • Η ανίχνευση του ιού HPV, ακόμη και σε επίπεδο DNA, μαρτυρά την ύπαρξη μόλυνσης του γεννητικού συστήματος από τον ιό, χωρίς ωστόσο να διευκρινίζει και την ύπαρξη ή όχι ενεργούς λοίμωξης, ειδικά στις περιπτώσεις που δεν υπάρχουν οι ορατές κλινικές ενδείξεις που να υποδηλώνουν κάτι τέτοιο (π.χ. κονδυλώματα, επιθηλιακές αλλοιώσεις). Η τελευταία, είναι απαραίτητη προϋπόθεση προκειμένου ο ιός να εκδηλώσει τις νοσογόνες επιπλοκές του, ειδικά στην περίπτωση της ογκογένεσης, όπου ο μετασχηματισμός των προσβεβλημένων κυττάρων είναι μία μακροχρόνια διαδικασία (10-20 έτη) κατά την οποία τα κύτταρα περνάνε από διάφορα στάδια εξαλλαγής (ASCUS→ASCH→LSIL→HSIL→Carcinoma). Είναι γεγονός ότι >95% των μολύνσεων από HPV αυτοπεριορίζονται αποτελεσματικά από το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή, ενώ μόνο το 0.1% των περιπτώσεων μόλυνσης από υψηλού-κινδύνου HPV υποτύπους θα εξελιχθούν τελικά σε καρκίνο. 
  • Πρωταρχική αιτία και κινητήρια δύναμη της κυτταρικής εξαλλαγής είναι η εμμένουσα λοίμωξη από HPV που σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες κινδύνου (π.χ. κάπνισμα, ανοσοκαταστολή, χρήση αντισυλληπτικών, σύγχρονη λοίμωξη από HSV-2, CMV, HHV-6/-7) διαταράσσει τη φυσιολογία του κυττάρου. Οι περιπτώσεις εμμένουσας λοίμωξης, ξεκινάνε από μία εγγενή ή επίκτητη αδυναμία του ανοσοποιητικού συστήματος του φορέα να αποβάλλει αποτελεσματικά το ιό HPV, ο οποίος σταδιακά ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του κυττάρου και αρχίζει να εκφράζει τα γονίδια του. Πρωταγωνιστικό ρόλο σε αυτή τη διαδικασία παίζουν τα ογκογονίδια Ε6 και Ε7 του ιού, που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες που συνδέονται άμεσα και καταστέλλουν δύο από τους ισχυρότερους ογκοκαταστολείς του κυττάρου, τις πρωτεΐνες p53 και pRB αντίστοιχα. Η δραστικότητα αυτών των συγκεκριμένων ιικών πρωτεϊνών (Ε6, Ε7) αποτελεί ουσιαστικά και τη πρωταρχική βιολογική βάση διαχωρισμού των διαφόρων υποτύπων του ιού HPV σε χαμηλού- και υψηλού-κινδύνου, καθώς στην κατηγορία των πρώτων η συγγένεια σύνδεσης τους με τις πρωτεΐνες p53 και pRB είναι μειωμένη, ενώ στη δεύτερη αρκετά ισχυρή και ως εκ τούτου επιδραστική. 
  • Η καινοτομία του HPV mRNA test έγκειται ακριβώς στη στόχευση αυτού του μοριακού μηχανισμού ογκογένεσης, όπου μέσω κατάλληλων ανιχνευτών αναλύεται ποιοτικά η έκφραση σε επίπεδο mRNA των γονιδίων Ε6 και Ε7 των 14 HPV υποτύπων υψηλού-κινδύνου. Ως δοκιμασία ελέγχου από το εργαστήριο μας εφαρμόζεται το APTIMA HPV mRNA test το οποίο είναι εγκεκριμένο από τον FDA και η απόδοση του μέσω κλινικών δοκιμών έδειξε ότι έχει παραπλήσια ευαισθησία με το HPV DNA test και αρκετά μεγαλύτερη ειδικότητα, αφού περιορίζει κατά 24% τον αριθμό των ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων. 
  • Δείγμα: επίχρισμα κυττάρων από το επιθήλιο του τραχήλου της μήτρας σε PreservCyt Solution (ThinPrep Pap Test vials).
  • Χρόνος απάντησης: 12-15 εργάσιμες ημέρες.